АТ

Антитромбин

Антитромбин (АТ, АТIII) является естественным антикоагулянтом, который играет ключевую роль в гемостазе путем ингибирования сериновых протеаз  — ф.IIa (тромбина), ф.Xa и в меньшей степени факторов ф.XIa и ф.IXa.

Антитромбин синтезируется в основном в печени и циркулирует в плазме как одноцепочечный белок, состоящий из 432 аминокислот с молекулярной массой 58,2 кД. Нормальный уровень АТ в плазме составляет 150 мкг/мл, а период полувыведения составляет около 3 дней.

АТ принадлежит к суперсемейству белковых ингибиторов сериновых протеиназ. Полипептидная цепь АТ содержит два основных функциональных домена – С-концевой, взаимодействующий с протеиназами, и N-концевой – с двумя сайтами связывания гепарина и гепарансульфатпротеогликанов поверхности клеток эндотелия.  АТ ингибирует протеиназы свертывания крови путем образования эквимолярного комплекса, однако процесс ингибирования происходит медленно, но прогрессивно ускоряется  гликозаминогликанами эндотелия и гепарином.

Методы определения активности АТ. Определение активности АТ основано на ингибировании им ф.IIa или ф.Xa в присутствии (либо без присутствия) гепарина при помощи хромогенного или клоттингового метода.

1. Хромогенный анализ: Наиболее распространенный метод определения активности АТ основан на способности АТ нейтрализовать тромбин в присутствии гепарина. Активность АТ определяют в плазме, добавляя к ней избыток тромбина или ф.Ха. При этом происходит ингибирование протеаз комплексом АТ-гепарин пропорционально количеству АТ в плазме. Оставшееся количество протеаз катализирует отщепление пара-нитроанилина (рNА) от синтетического хромогенного субстрата. Абсорбция свободного pNA, определяемая при 405 нм, обратно пропорциональна активности АТ.

Процесс идет по следующей схеме:

АТ + гепарин (избыток) ⇒ АТ-гепарин.

АТ-гепарин + тромбин (избыток) ⇒
АТ-гепарин-тромбин + тромбин (остаток).

Субстрат-рNA + тромбин (остаток) ⇒ Пептид + рNA.

(См.инструкцию к Реахром-АТIII-тесту)

2. Клоттинговый метод (по Abildgaard): в исследуемой плазме тепловой обработкой удаляют фибриноген, вносят стандартное количество тромбина, смесь инкубируют и затем определяют в ней остаточную (после взаимодействия с антитромбином) активность тромбина. Активность тромбина определяют по времени свертывания стандартного раствора фибриногена. Чем выше активность антитромбина в исследуемой плазме, тем ниже остаточная активность тромбина, и тем медленнее происходит образование сгустка. Активность АТ в % определяют по калибровочному графику, построенному с помощью плазмы-калибратора.

(См. инструкцию к Реаклот-АТIII-тесту)

Иммунологические методы исследования — ИФА применяются для определения общего антигенного уровня антитромбина обычно измеряется при помощи «сэндвич»-метода.

Референсные значения

Диапазон нормальных величин для активности АТ у взрослого человека является активность АТ 80-120%. Новорожденные имеют сниженный уровень АТ при рождении (30-50% от уровня взрослого), но он поднимается примерно до 60% от уровня взрослых в первый месяц после рождения.

Интерпретация результатов

Диагностическая значимость метода. Дефицит АТ ассоциируется с повышенным риском венозной тромбоэмболии и может быть обнаружен у 1-2% пациентов с венозной тромбоэмболией по сравнению с 0,02-0,2% в общей популяции.

Снижение концентрации АТ может быть генетически обусловленным (врожденный дефицит АТ, первичная тромбофилия) либо приобретенным.

Дефицит АТ, определяется при помощи иммунологических (количественных) и функциональных (качественных) методов анализа.

В зависимости от уровня антигена АТ в плазме и его активности различают два типа врожденного дефицита АТ с подтипами:

Тип I – количественный дефицит АТ вследствие нарушения его синтеза, либо нарушения его секреции из гепатоцитов, с параллельным  снижением активности АТ примерно на 50% от нормы. Тип I дефицита АТ изначально был поделен на две подгруппы Iа и Ib, на основе сродства к гепарину (Іа — нормальное сродство АТ к гепарину, Іb — снижение сродства АТ к гепарину). В пересмотренной классификации, принятой Научным Комитетом по стандартизации Международного общества по изучению тромбозов и гемостаза, тип 1b исключен. В большинстве случаев I тип дефицита АТ реализуется за счет точечных мутаций, делеций или незначительных вставок в ген АТ.

Тип II характеризуется нормальным уровнем АТ со сниженной его активностью в плазме и подразделяется на три подгруппы IIа, IIb и IIc в зависимости от функциональной активности АТ и степени сродства АТ к гепарину.

— ІIа подгруппа — снижение инактивации тромбина, снижение инактивации ф.Xа и снижение сродства к гепарину. В основе механизма – мутации, влияющие на гепарин-связывающий домен АТ;

— ІIb подгруппа — снижение инактивации тромбина и нормальное сродство к гепарину. В основе механизма – мутации, влияющие на реактивный сайт молекулы АТ;

— ІIс подгруппа — нормальная инактивация тромбина, нормальная инактивация ф.Xа и снижение сродства к гепарину. В основе механизма – мутации, влияющие как гепарин-связывающий домен АТ, так и на реактивный сайт молекулы АТ.

Приобретенный дефицит АТ может быть обусловлен сниженным синтезом в печени, интенсивным потреблением (например, при ДВС-синдроме, массивных тромбозах), ускоренным метаболизмом АТ (при лечении гепарином, преимущественно, при введении нефракционированного гепарина, L-аспарагиназой, эстрогенными контрацептивными средствами) или потерей АТ при нефротическом синдроме и заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Во всех этих случаях отмечают параллельное снижение концентрации и активности АТ.

Антикоагулянтное действие гепарина определяется концентрацией АТ в крови. При значимом снижении концентрации АТ для достижения антитромботического действия требуется введение все больших доз нефракционированного гепарина, что может приводить к дальнейшему снижению уровня АТ и развитию гепаринорезистентности. В этом случае определение активности АТ во время гепаринотерапии может стать причиной ошибочных выводов о наличии врожденного дефицита АТ.

Повышение концентрации АТ может наблюдаться при воспалительных и онкологических процессах, при дефиците витамина К или при лечении оральными антикоагулянтами (варфарином).

Что надо знать об АТ:

1. Первоначально было описано 6 АТ (I-VI), и наиболее значимым в системе гемостаза был признан  антитромбин III (АТ III). В настоящее время общепринятым является укороченное название – антитромбин (АТ).
2. Укороченный период инкубации плазмы при проведения исследования делает анализ чувствительным к гепарину, тогда как длительный инкубационный период делает анализ менее чувствительным к гепарину.
3. Существует тест по определению АТ (Progressive Antitrombin Assay) без использования гепарина, cхожий с классическим хромогенным тестом. В данном тесте время инкубации всего несколько минут, и поэтому ингибирование субстрата может происходить не только из-за АТ, но и других сериновых протеаз, присутствующих в плазме. Использование гепарина в тестах повышает активность АТ в несколько тысяч раз и делает тест чувствительным только к АТ.
4. Полный дефицит АТ не описан в клинической практике, вероятно, в связи с его несовместимостью с жизнью.
5. У лиц с низким содержанием АТ важно установить тип дефицита АТ при помощи генетического анализа. В настоящее время идентифицировано более 250 мутаций в гене АТ, большинство из которых приводят к замене в аминокислотной последовательности данного белка.
6. При пониженной активности АТ (ниже 75%) другие показатели гемостаза (базовые тесты, агрегация тромбоцитов, активность показателей фибринолиза) могут быть в пределах нормальных значений, при этом риск развития венозных тромбозов может оставаться высоким.

При подготовке раздела использованы данные научного сайта www.practical—hemostasis.com.